خالص سازی و تعیین ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم های پروتئاز و لیپاز کرم گلوگاه انار ectomyelois ceratoniae

کرم گلوگاه انارectomyelois ceratoniae zeller (lepidoptera: pyralidae) از آفات مهم انار و پسته در ایران است. فعالیت پروتئازی و لیپازی در روده میانی لارو سن پنج e. ceratoniae برای به دست آوردن نوع پروتئاز و ویژگی آنها جهت استفاده در روش های مدیریتی کنترل آفت مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت پروتئولیتیکی وجود پروتئینازهای الاستاز، تریپسین و کیموتریپسین و دو اگزوپپتیداز را اثبات کرد. دمای بهینه در فعالیت پروتئولیتیکی کل با استفاده از آزوکازئین و کازئین به عنوان سوبسترا به ترتیب 30 و 35 درجه سلسیوس به دست آمد. در صورتی که در مورد هموگلوبین در محدوده دمایی 15 تا 35 درجه سلسیوس مشاهده شد. کاتیون های مختلف نه تنها باعث افزایش بلکه بعضی از آنها باعث کاهش شدید فعالیت پروتئولیتیکی شدند، هر چند sds، اسید سیتریک و مرکاپتواتانول به طور معنی داری باعث کاهش شدند. استفاده از بازدارنده های اختصاصی شامل: pmsf، tlck، tpck، e-64، dtt و فنانترولین وجود سرین پروتئینازها را به عنوان پروتئاز اصلی اثبات کرد، که پروتئازهای تریپسین مانند به طور قابل ملاحظه ای از سایرین فعال تر بودند. برای توسعه استراتژی های بهتر کنترل، خالص سازی و بررسی ویژگی های پروتئاز تریپسین مانند به وسیله ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی تبادل یونی به دست آمد، که ضریب خالص سازی 35/23، بازیابی 04/27، فعالیت اختصاصی u/mg protein 07/66 و وزن ملکولی 8/35 کیلودالتون محاسبه شد. خصوصیات بیوشیمیایی پروتئاز خالص شده بیشترین فعالیت آنزیمی را در اسیدیته 9 و دمای بهینه 20 نشان داد. همچنین، بازدارنده پروتئیناز از چهار رقم انار استخراج شد که رقم های بریت، می خوش، ترش سبز و شیرین دارای اثر بازدارندگی روی تریپسین بودند. خالص سازی لیپاز نیز به وسیله سولفات آمونیوم و دو ستون کروماتوگرافی صورت گرفت، که میزان پروتئین u/mg 4/0، فعالیت اختصاصی u/mg protein 62/29، بازیابی 57/28 و وزن ملکولی 25 کیلودالتون محاسبه شد. اسیدیته و دمای بهینه لیپاز خالص شده به ترتیب 7 و 30 درجه سلسیوس به دست آمد. همچنین آنزیم به مدت 3 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس پایدار بود. غلظت های مختلف pmsf و edta با لیپاز خالص شده انکوبه شدند که edta هیچگونه اثر بازدارندگی نداشت، اما pmsf به طور معنی داری فعالیت آنزیمی را کاهش داد که در ژل الکتروفورز نیز مشاهده شد.